前言 ? ? ? ?毒理學(xué)研究是藥物非臨床安全性評價的重要內(nèi)容，臨床前毒理數(shù)據(jù)有助于我們了解藥物的毒理學(xué)特征，從而進(jìn)行科學(xué)合理的設(shè)計，并為藥物臨床試驗(yàn)開發(fā)提供重要依據(jù)，最大可能降低藥物副作用或臨床風(fēng)險，對于創(chuàng)新藥開發(fā)來說至關(guān)重要。 ? ? ? ?毒理試驗(yàn)中，毒理劑量是試驗(yàn)設(shè)計的核心內(nèi)容，今天就來盤點(diǎn)一下各國指導(dǎo)原則中對毒理學(xué)劑量設(shè)計的要求和建議。
——? 01? —— NMPA《藥物單次給藥毒性技術(shù)指導(dǎo)原則》
? ? ? ?單次給藥毒性試驗(yàn)的重點(diǎn)在于觀察動物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。單次給藥毒性試驗(yàn)的試驗(yàn)方法較多，常用的試驗(yàn)方法有近似致死量法、最大給藥量法（注釋1）、最大耐受量法法（注釋2）、固定劑量法、上下法（序貫法）、累積劑量法（金字塔法）、半數(shù)致死量法（注釋3）等。應(yīng)根據(jù)受試物的特點(diǎn)選擇合適的方法，根據(jù)不同的試驗(yàn)方法選擇合適的劑量。原則上，給藥劑量應(yīng)包括從未見毒性反應(yīng)的劑量到出現(xiàn)嚴(yán)重毒性反應(yīng)的劑量，或達(dá)到最大給藥量。
——? 02? —— NMPA《藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》
? ? ? ?《藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》中指出：重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)原則上至少應(yīng)設(shè)低、中、高 3個劑量組，以及1個溶媒（或輔料）對照組，必要時設(shè)立空白對照組和/或陽性對照組；高劑量原則上使動物產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)，低劑量原則上相當(dāng)或高于動物藥效劑量或臨床使用劑量的等效劑量，中劑量應(yīng)結(jié)合毒性作用機(jī)制和特點(diǎn)在高劑量和低劑量之間設(shè)立，以考察毒性的劑量-反應(yīng)關(guān)系。劑量設(shè)計應(yīng)考慮之前進(jìn)行的各項(xiàng)試驗(yàn)所評價的終點(diǎn)、受試物的理化性質(zhì)和生物利用度等；局部給藥應(yīng)保證充分的接觸時間。高劑量應(yīng)出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，或達(dá)到最大給藥量（Maximum Feasible Dose, MFD），或系統(tǒng)暴露量達(dá)到臨床系統(tǒng)暴露量的50倍（基于AUC）。如需要在試驗(yàn)中途改變給藥劑量，應(yīng)說明劑量調(diào)整理由，完整記錄劑量調(diào)整過程。
——? 03? —— ICH-S6(R1)：《生物技術(shù)藥物的臨床前安全性評價》
? ? ? ?劑量選擇應(yīng)反應(yīng)劑量-反應(yīng)關(guān)系，包括毒性劑量和未見不良反應(yīng)的劑量（NOAEL）。應(yīng)提供劑量選擇依據(jù)及其預(yù)計的人體暴露量倍數(shù)。當(dāng)產(chǎn)品在所選動物細(xì)胞中的親和力或效價低于人體細(xì)胞時，使用更高劑量進(jìn)行試驗(yàn)非常重要。用于確定足夠安全范圍所需的人用劑量倍數(shù)，可能隨生物制品的類別及其臨床適應(yīng)癥而有所不同。此外可通過PK/PD模型提供： ? ? ? ?1. 臨床前種屬預(yù)期最大藥理學(xué)作用的劑量；
? ? ? ?2. 暴露量約為臨床最大暴露10倍的劑量。 ? ? ? ?在臨床前毒性試驗(yàn)中應(yīng)該選擇上述兩種劑量中的較高者，除非有合理的理由選用較低劑量（如最大的可行劑量）。
——? 04? —— ICH-M3(R2)：支持藥物進(jìn)行臨床試驗(yàn)和上市的非臨床安全性研究指導(dǎo)原則
? ? ? ?通常，當(dāng)毒理學(xué)試驗(yàn)的劑量達(dá)到最大耐受量（MTD）時，可以充分闡明具有潛在臨床相關(guān)性的毒性反應(yīng)。但不是每個試驗(yàn)都必須證明達(dá)到MTD。其他同樣適當(dāng)?shù)南薅▌┝窟€包括達(dá)到最大暴露倍數(shù)的劑量、暴露飽和劑量或最大可行劑量（MFD）。這些限定劑量（詳見下文和圖1)可以避免在動物中使用無益于預(yù)測臨床安全性的劑量。這些建議與生殖和致癌性試驗(yàn)設(shè)計中有關(guān)限定劑量和（或）暴露的建議是一致的。 ? ? ? ?除以下情況外，1000mg/(kgd)作為嚙齒類和非嚙齒類動物急性、亞急性、慢性毒性試驗(yàn)的限定劑量都是合適的。在個別情況下，1000mg/(kgd)的平均暴露劑量達(dá)不到臨床暴露量的10倍，而臨床劑量超過1g/d，毒性試驗(yàn)應(yīng)以暴露量達(dá)到臨床暴露量的10倍、2000mg/(kgd)、MFD三者中的最低者作為高劑量。在極個別情況下，2000mg/(kgd)產(chǎn)生的暴露量可能低于臨床暴露量，此時可以考慮更高的MFD作為高劑量。 ? ? ? ?在任何種屬中進(jìn)行的急性和重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)，通常都可以接受將暴露量達(dá)到臨床全身暴露50倍【通?；谠退幓蚯八幍乃幚砘钚苑肿拥慕M平均AUC】的劑量作為最高劑量。 ? ? ? ?為了支持在美國進(jìn)行的III期臨床試驗(yàn)，當(dāng)以暴露量達(dá)到臨床暴露量50倍的劑量作為限定劑量時，至少應(yīng)在一個種屬中確定劑量限制性毒性。否則，建議在一個種屬中進(jìn)行一項(xiàng)一個月或更長期限的毒性試驗(yàn)，以1000mg/(kg.d)、MFD、MTD三者中的最低者作為高劑量 。但是基于具體問題具體分析的原則，如果在一項(xiàng)期限更短的試驗(yàn)中在高于產(chǎn)生臨床暴露50倍的劑量下找到了劑量限制性毒性，則無需進(jìn)行該試驗(yàn)。 ? ? ? ?如果將遺傳毒性終點(diǎn)整合入一般毒性試驗(yàn)中，那么應(yīng)基于MFD、MTD或者限定劑量1000mg/(kg.d)來選擇作為合適的最高劑量。 ? ? ? ?一般毒理試驗(yàn)高劑量選擇的推薦方法詳見下圖： 
——? 05? —— ICH-S3A：《毒代動力學(xué)指導(dǎo)原則說明：毒性研究中的全身暴露量評價》
? ? ? ?毒代動力學(xué)研究通常結(jié)合于毒性研究中，故又被稱為伴隨毒代動力學(xué)，藥物暴露直接影響藥物的藥理學(xué)特性，毒代動力學(xué)揭示毒性研究中藥物的動力學(xué)過程，有助于解釋毒理學(xué)發(fā)現(xiàn)和制定合理的試驗(yàn)設(shè)計，ICH-S3A中對劑量設(shè)計的建議如下： ? ? ? ?1. 低劑量：低劑量最好是無毒性反應(yīng)劑量（注釋 4），任何毒性試驗(yàn)中低 4劑量的動物暴露水平，理想狀態(tài)下應(yīng)等同或略高于患者擬用（或已知）的最高劑量。但該理想狀態(tài)并非總是可以達(dá)到，故低劑量通常視毒理學(xué)考慮而定。無論如何應(yīng)進(jìn)行全身暴露量測定。
? ? ? ?2. 中劑量：根據(jù)毒性試驗(yàn)?zāi)康?，中劑量的暴露通常是低劑量的適當(dāng)倍數(shù)或高劑量的適當(dāng)分?jǐn)?shù)。
? ? ? ?3. 高劑量：毒性試驗(yàn)中高劑量通常依毒理學(xué)的要求而定，但所用劑量應(yīng)達(dá)到可評價的暴露水平。
——? 06? —— FDA：藥物單劑量急性毒性試驗(yàn)
? ? ? ?FDA于1996年8月發(fā)布的《SINGLE DOSE ACUTE TOXICITY TESTING FOR PHARMACEUTICALS》中，對單次給藥毒理劑量設(shè)計做出了以下建議：用于動物實(shí)驗(yàn)的供試品，應(yīng)確定不會產(chǎn)生不良影響的劑量和造成重大(危及生命的)毒性的劑量。應(yīng)設(shè)置對照組。對于毒性較低的化合物，應(yīng)給予最大可行劑量（MFD）。 
——? 07? —— FDA：Redbook紅皮書
? ? ? ?FDA的紅皮書中，對毒性試驗(yàn)劑量設(shè)計也給出了建議：每個性別至少應(yīng)設(shè)置3個供試品劑量水平，但如果可以使用4或5個試驗(yàn)物質(zhì)劑量水平更好。應(yīng)設(shè)置對照組。毒性研究的劑量選擇應(yīng)基于與試驗(yàn)物質(zhì)的毒性有關(guān)的信息。在毒性研究中，供試品應(yīng)至少設(shè)置三個劑量組和一個對照組。在設(shè)計和進(jìn)行毒性研究時，應(yīng)考慮以下因素: ? ? ? ?1. 高劑量應(yīng)足以引起試驗(yàn)動物的毒性反應(yīng);
? ? ? ?2. 低劑量不引起實(shí)驗(yàn)動物的毒性反應(yīng);
? ? ? ?3. 中間劑量應(yīng)足夠高，能在試驗(yàn)動物身上引起最小的毒性作用(如改變酶水平或體重增加的輕微下降)。 ? ? ? ?任何劑量都不應(yīng)造成死亡發(fā)生率，從而阻止對數(shù)據(jù)進(jìn)行有意義的評估。所有劑量組應(yīng)同時給予試驗(yàn)物質(zhì)。
——? 08? —— EMA：重復(fù)給藥毒性指導(dǎo)原則
? ? ? ?歐盟EMA在2010年發(fā)布的《Guideline on repeated dose toxicity》中，對毒理劑量設(shè)計的建議如下： ? ? ? ?一般來說，毒理劑量設(shè)計應(yīng)包括： ? ? ? ?1. 合適的對照組，在特殊情況下，可能需要一個陽性對照組，例如在具有特殊生物學(xué)終點(diǎn)的毒物研究中(例如基因毒性，請參閱指導(dǎo)原則ICH S2 (R1)以獲得進(jìn)一步指導(dǎo))。
? ? ? ?2. 一個低劑量，足以產(chǎn)生藥效學(xué)效應(yīng)或預(yù)期的治療效果，或產(chǎn)生與預(yù)期臨床使用時相當(dāng)水平的系統(tǒng)暴露。
? ? ? ?3. 一個高劑量，用以確定靶器官毒性或其他非特異性毒性，或達(dá)到給藥體積限制劑量。大部分情況下，嚙齒類和非嚙齒類動物的急性、亞慢性和慢性毒性研究的限制劑量可設(shè)為1000mg/(kg.d)，除ICH M3 (R2)指南中討論的其他情況。
? ? ? ?4. 一個中劑量，可以是高劑量和低劑量的幾何平均值。 ? ? ? ?理想情況下，在高劑量水平下，藥物和/或主要代謝物的全身暴露應(yīng)是預(yù)期臨床全身暴露的一定倍數(shù)。?
? ? ? ?自2017年中國加入ICH成員國并擔(dān)任管委會成員，藥物國際化趨勢加快，ICH指導(dǎo)原則全面推行，中國藥政法規(guī)與國際接軌，NMPA鼓勵創(chuàng)新，縮短了研發(fā)的周期，對于藥物研發(fā)來說是非常有利的。綜合各法規(guī)來看，各國對毒理試驗(yàn)劑量的設(shè)計要求總體一致，科學(xué)合理的毒理試驗(yàn)劑量設(shè)計有利于充分了解毒理學(xué)發(fā)現(xiàn)，預(yù)知毒理作用的出現(xiàn)劑量，從而為臨床試驗(yàn)提供充分的依據(jù)，保護(hù)受試者權(quán)益，創(chuàng)新藥物的毒理研究尤其重要，而毒理試驗(yàn)設(shè)計不合理，可能在藥物IND注冊審評階段就遭遇發(fā)補(bǔ)或者更壞的結(jié)果，所以要從藥物的本身特點(diǎn)出發(fā)，結(jié)合法規(guī)要求，同時在case-by-case的原則之上，做充分的研究。藥物的藥理作用有兩面性，因此找到藥效和毒理作用之間的安全窗口，達(dá)到風(fēng)險和獲益的平衡，才能最大程度發(fā)揮藥物的作用。
注釋： 注釋1：最大給藥量（Maximal feasible dose，MFD）：指動物單次或24小時內(nèi)多次（2~3次）給藥所采用的最大給藥劑量。 注釋2：最大耐受量（Maximal tolerance dose，MTD）：是指動物能夠耐受的而不引起動物死亡的最高劑量。 注釋3：半數(shù)致死量（Median lethal dose，LD50）：預(yù)期引起50%動物死亡的劑量，該值是經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理所推算出的結(jié)果。 注釋4：無毒性反應(yīng)劑量：（被認(rèn)為等同于“未見不良反應(yīng)劑量”）定義為：在該劑量下，可能觀察到某些藥理學(xué)作用，但未見不良反應(yīng)。?
參考文獻(xiàn)： [1] 藥物單次給藥毒性技術(shù)指導(dǎo)原則. NMPA，2014.5. [2] 藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則.NMPA，2014.5. [3] ICH-S6(R1)：Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals, 2011. [4] ICH-M3(R2)：Guidance on Nonclinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals,2009. [5] ICH-S3A：Note for Guidance on Toxicokinetics: The Assessment of Systemic Exposure in Toxicity Studies,1994. [6] FDA：Single Dose Acute Toxicity Testing for Pharmaceuticals, 1996. [7] Redbook 2000 IV.C, FDA 2003，2007. [8]Guideline on repeated dose toxicity, EMA 2010.3.
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