? ? ? ?導(dǎo)語：近年來，雙特異性抗體（BsAb）的發(fā)展已成為治療凝血功能缺陷和癌癥的一種有前景的策略。T細(xì)胞雙特異性抗體(BsAbs)將細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，誘導(dǎo)其破壞。盡管目前有60多種雙抗正在開發(fā)中，但諸如域間間距或空間構(gòu)型等參數(shù)的相對(duì)重要性在很大程度上是未知的。 ? ? ? ?本文中，Santich等剖析了一個(gè)對(duì)稱的二價(jià)雙抗（IgG-[L]-scFv:anti-CD3單鏈抗體與輕鏈融合的抗腫瘤IgG），以探討價(jià)態(tài)和空間構(gòu)型對(duì)BsAb誘導(dǎo)的T細(xì)胞毒性的重要性。他們的結(jié)果顯示，在體外和體內(nèi)，將腫瘤和T細(xì)胞結(jié)合域放置在BsAb（順式構(gòu)型）的同一側(cè)，與將它們定位在相反側(cè)（反式構(gòu)型）相比，在體外和體內(nèi)都能產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤活性。此外，在同一個(gè)BsAb中使用兩個(gè)順式結(jié)構(gòu)進(jìn)一步提高了細(xì)胞毒性(高達(dá)2000倍)。此外，與較小的(G4S1)或較大的(CH1-CH2-CH3)間隔相比，單個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域(CL)分離抗原結(jié)合成分顯著增強(qiáng)細(xì)胞因子釋放和體內(nèi)腫瘤反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)為改善BsAb的功能提供了指導(dǎo)，并強(qiáng)調(diào)了空間構(gòu)型和雙二價(jià)作為開發(fā)參數(shù)的重要性。 ? ? ? ?Santich等以IgG-[L]-scFv架構(gòu)的BsAb為研究對(duì)象，其中之一就是單鏈可變片段（scFv）識(shí)別人CD3（huCD3ε）與每個(gè)IgG抗體輕鏈的C末端融合（圖1A）。盡管這種設(shè)計(jì)在體內(nèi)和體外對(duì)多種腫瘤抗原均具有極強(qiáng)的抗腫瘤活性[GD2(13)、CD33(10)、GPA33(11)和HER2(12)]，其療效的基礎(chǔ)尚不清楚。通過研究，他們發(fā)現(xiàn)：（1）雙抗價(jià)態(tài)對(duì)提高其體外細(xì)胞毒性具有重要意義；（2）使用單個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域（CL）分離腫瘤和T細(xì)胞結(jié)合域可以顯著改善體外細(xì)胞因子分泌和體內(nèi)抗腫瘤反應(yīng)；（3）將腫瘤和T細(xì)胞結(jié)合域放在BsAb（順式結(jié)構(gòu)）的同一側(cè)可將細(xì)胞毒性作用提高50倍。 圖1. IgG-[L]- scFv與常見BsAb設(shè)計(jì)的體外比較。2+2為紫色，1+1B為藍(lán)色，1+1H為紅色。每條曲線代表一個(gè)BsAb，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)濃度。 一、IgG-[L]-scFv格式比其他常見的BsAb設(shè)計(jì)更有效 ? ? ? ?Santich等通過將IgG-[L]-scFv結(jié)構(gòu)與廣泛用于T細(xì)胞重定向應(yīng)用的兩種BsAb結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較來進(jìn)行研究：雙特異性T細(xì)胞銜接器（BiTE；與FDA批準(zhǔn)的博納吐單抗（Blinatumomab）結(jié)構(gòu)相同）和IgG異二聚體（圖 1A）。使用人源化的3F8（hu3F8）和人源化的OKT3（huOKT3）的可變域序列，分別設(shè)計(jì)每個(gè)BsAb識(shí)別腫瘤細(xì)胞上的神經(jīng)節(jié)苷脂GD2（GD2）和T細(xì)胞上的huCD3ε。BiTE和IgG-[L]-scFv BsAb均使用標(biāo)準(zhǔn)的哺乳動(dòng)物表達(dá)和親和純化方法生產(chǎn)，而IgG異二聚體是通過兩種不同的IgG同二聚體（hu3F8 IgG和huOKT3 IgG）的受控Fab臂交換制得。對(duì)于這些親本IgG分子中的每一個(gè)，都引入了兩個(gè)Fc突變之一（帶有K409R的hu3F8或帶有F405L的huOKT3），以促進(jìn)它們?cè)谶€原條件下的單體化和優(yōu)先異二聚化（圖1B）。 ? ? ? ?通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估與表達(dá)抗原的細(xì)胞的結(jié)合（圖1C），用識(shí)別了抗huCD3β（以測(cè)量GD2結(jié)合）或抗GD2的抗獨(dú)特型抗體檢測(cè)結(jié)合的BsAb（測(cè)量CD3結(jié)合）的每個(gè)BsAb。在此，就最大有效濃度和半最大有效濃度（EC50）而言，2+2結(jié)合的GD2+人類M14黑色素瘤細(xì)胞比1+1H或1+1B更有效，而所有三種形式均與激活的人類T細(xì)胞（huATC）類似地結(jié)合。 ? ? ? ?體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)（圖1D）顯示，2+2的效力是1+1H的500倍以上，效力是1+1B的20倍以上。這些結(jié)果表明2+2相對(duì)于1+1H的細(xì)胞毒性優(yōu)勢(shì)至少部分歸因于分子的形式。 ? ? ? ?接下來，他們研究了2+2在體外增強(qiáng)的效力是否會(huì)轉(zhuǎn)化為更強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤活性(圖2)。首先，他們使用了免疫缺陷的異種移植小鼠模型IL-2rg?/?Rag2?/?BALB/c雙敲除(DKO)小鼠(圖2A)。DKO小鼠被皮下植入人類黑色素瘤(M14)、靜脈注射huATCs和BsAbs。2+2具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可縮小大型腫瘤(高達(dá)1000mm3)，而1+1H相對(duì)于對(duì)照組BsAbs (一種針對(duì)無關(guān)腫瘤抗原的IgG-[L]-scfv)沒有作用(圖2B)。 圖2. IgG- [L] -scFv與常見BsAb設(shè)計(jì)的體內(nèi)比較。2+2為紫色，1+1H為紅色，對(duì)照BsAb為灰色。 ? ? ? ?2+2和1+1B在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性差異很大，這使得兩者的比較變得復(fù)雜；1+1B的血清半衰期為15分鐘(18)，而2+2的半衰期為3天。為了解決這個(gè)問題，他們使用了離體的“武裝”T細(xì)胞（EAT）異種移植模型，其中huATCs先與BsAbs結(jié)合，洗滌后再注射到成神經(jīng)細(xì)胞瘤患者衍生的異種移植（PDX）的DKO小鼠中。目的是創(chuàng)造嵌合抗原受體(CAR)樣T細(xì)胞，在過繼轉(zhuǎn)移前獲得其與腫瘤結(jié)合的潛能。它們隨后抗腫瘤功能上的任何差異都可能直接與用來“武裝”它們的BsAb的細(xì)胞毒性效力有關(guān)。在這些實(shí)驗(yàn)中，對(duì)2+2、1+1B和1+1H預(yù)孵育方案進(jìn)行了優(yōu)化，使所有EATs都含有相當(dāng)數(shù)量的抗GD2結(jié)合結(jié)構(gòu)域。3個(gè)BsAbs在37℃的體外條件下與huATCs穩(wěn)定結(jié)合達(dá)3天，表明EATs可以被當(dāng)作CAR樣T細(xì)胞處理。然而，在體內(nèi)，2+2 EAT具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，而1+1H和1+1B EAT均未顯示任何益處。這些結(jié)果證實(shí)了2+2的增強(qiáng)功效，并證明其優(yōu)勢(shì)并不僅僅來自其藥代動(dòng)力學(xué)。綜上，他們的體外數(shù)據(jù)和三種不同的動(dòng)物模型的結(jié)果表明，IgG-[L]-scfv結(jié)構(gòu)比BiTE或IgG異源二聚體結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)。 二、域間間隔對(duì)于IgG- [L] -scFv格式的抗腫瘤活性至關(guān)重要 ? ? ? 接下來，他們?cè)u(píng)估了另外兩種雙二價(jià)BsAb結(jié)構(gòu)(圖3A)，一種是IgG-[H]-scfv (2+2HC)和一種基于IgG1的人BiTE-Fc (2+2B)。與使用單個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域（CL）分離腫瘤和T細(xì)胞結(jié)合成分的2+2相反，2+2HC通過融合每個(gè)抗huCD3 scFv將間隔增加到三個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域（CH1-CH2-CH3）每個(gè)抗GD2重鏈的C末端。相反，2+2B在每對(duì)scFv之間使用一個(gè)短的(G4S1)連接子來減少腫瘤和T細(xì)胞結(jié)合區(qū)域之間的距離。在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中，三種BsAb與GD2+人M14黑色素瘤細(xì)胞相比較(圖3B)；但是，它們與T細(xì)胞的結(jié)合卻出乎意料地不同。2+2B最有效地結(jié)合，相對(duì)于2+2和2+2HC，最大結(jié)合和EC50均顯示出增強(qiáng)。2+2HC表現(xiàn)出比2+2大10倍的T細(xì)胞結(jié)合能力，具有相當(dāng)?shù)淖畲蠼Y(jié)合能力。這些結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)域間的間距對(duì)于T細(xì)胞的緊密結(jié)合至關(guān)重要，并暗示，與2+2B結(jié)構(gòu)不同，2+2和2+2HC可能不能一致的二價(jià)CD3結(jié)合。 圖3.雙二價(jià)BsAb設(shè)計(jì)的比較。橙色代表抗huCD3（源自huOKT3），藍(lán)色代表抗GD2域（源自hu3F8）。2+2為紫色，2+2B為藍(lán)色，2+2HC為綠色。 ? ? ? ?出乎意料的是，與2+2相比，2+2B和2+2HC均表現(xiàn)出較2+2降低的體外細(xì)胞毒性（圖3C），與2+2相比，2+2的溶解度降低了約2-3倍（分別為80和140fM EC50，而2+2中為38fM）。為了進(jìn)一步研究體外功能的這些差異，他們使用T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子釋放作為下游讀數(shù)，對(duì)未加工的人類T細(xì)胞和GD2+M14黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行了共培養(yǎng)測(cè)定（圖3D）。就總體反應(yīng)和效力而言，與2+2HC或2+2B相比，2+2誘導(dǎo)的白介素2（IL-2）細(xì)胞因子釋放明顯增強(qiáng)。2+2還引起早期反應(yīng)表面標(biāo)記CD69和CD25的更強(qiáng)上調(diào)，證實(shí)2+2激活的T細(xì)胞比2+2B或2+2HC更有效。在沒有腫瘤細(xì)胞的情況下，BsAbs均未誘導(dǎo)可測(cè)量的細(xì)胞因子釋放或T細(xì)胞激活，表明這些反應(yīng)完全依賴于抗原。 圖4. 雙二價(jià)BsAb設(shè)計(jì)的體內(nèi)比較。2+2為紫色，2+2B為藍(lán)色，2+2HC為綠色，對(duì)照組(無BsAb)為灰色。 ? ? ? ?為了確定結(jié)構(gòu)域間距對(duì)體內(nèi)腫瘤反應(yīng)的影響，他們使用兩種常規(guī)方法比較這三種結(jié)構(gòu)(圖4)。在這兩種方法中，只有2+2激發(fā)了強(qiáng)大的抗腫瘤反應(yīng)，而2+2B和2+2HC顯示出的效果與對(duì)照組相差不大。這些結(jié)果是出乎意料的，他們提出兩個(gè)觀點(diǎn)：①光憑二價(jià)不足以產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤效力；②結(jié)構(gòu)域間距的減小不一定會(huì)增加細(xì)胞毒性。相反，2+2設(shè)計(jì)的優(yōu)越性表明，最優(yōu)的結(jié)構(gòu)域間距和空間構(gòu)型對(duì)于體內(nèi)外抗腫瘤反應(yīng)的產(chǎn)生至關(guān)重要。 三、價(jià)態(tài)可提高IgG-[L]-scFv結(jié)構(gòu)的腫瘤和T細(xì)胞結(jié)合 ? ? ? ?為了確定具有顯著抗腫瘤活性的IgG-[L]-scFv結(jié)構(gòu)的特性，Santich等設(shè)計(jì)了四種新的IgG-[L]-scFv異源二聚體(圖5)，它們代表了所有可能的價(jià)和結(jié)構(gòu)域間空間構(gòu)型的組合。 圖5. 系列IgG- [L] -scFv的體外結(jié)合活性。圖A、B中，橘色域代表anti-huCD3、藍(lán)色領(lǐng)域代表anti-GD2、黑色條紋域代表無關(guān)anti-CD33。圖D：共軛分析原理圖(左)和結(jié)果圖表(右)。未共軛細(xì)胞(左上和右下象限)在一個(gè)通道下顯示熒光，而共軛細(xì)胞(右上象限)在兩個(gè)通道下顯示熒光。分析時(shí)，以偶聯(lián)T細(xì)胞在總T細(xì)胞中的比例(紅色方框)來測(cè)量偶聯(lián)頻率。2+2為紫色，1+1H為紅色，2+1為藍(lán)色，1+1T為綠色，1+1C為棕色，1+2為橙色，對(duì)照BsAb為灰色。 ? ? ? ?SPR（surface plasmon resonance，表面等離子體共振）及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果均顯示，二價(jià)BsAb比單價(jià)BsAb更能與細(xì)胞相關(guān)抗原結(jié)合（圖5C）。為了評(píng)估當(dāng)兩種抗原同時(shí)結(jié)合時(shí)，與GD2和huCD3結(jié)合的差異是如何產(chǎn)生的，他們進(jìn)行了體外細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)（圖5D）。流式結(jié)果顯示，2+2在本實(shí)驗(yàn)中最有效，其次是2+1，其余結(jié)構(gòu)（1+2、1+1T、1+1C和1+1H）的活性明顯降低。 ? ? ? ?這些結(jié)果表明，二價(jià)體，特別是對(duì)腫瘤的作用，改善了結(jié)合物的形成，是細(xì)胞毒性的重要一步。1+1C和1+1T結(jié)合抗原或誘導(dǎo)結(jié)合物的能力差異不明顯，說明腫瘤和T細(xì)胞結(jié)合域的空間構(gòu)型不影響結(jié)合物的形成。 四、空間構(gòu)型決定IgG-[L]-scFv的體內(nèi)外功能 ? ? ? ?M14黑色素瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示，系列IgG-[L]-scFv存在顯著差異（圖6A）。2+2誘導(dǎo)的抗腫瘤細(xì)胞毒性最強(qiáng)（26fM，EC50），其次是2+1（240fM，EC50）和1+2（773fM，EC50），分別是9倍和30倍。 圖6. 系列IgG-[L]- scFv體外功能活性研究。2+2為紫色，1+1H為紅色，2+1為藍(lán)色，1+1T為綠色，1+1C為棕色，1+2為橙色，控制組BsAb為灰色。 ? ? ? ?為了探索價(jià)數(shù)和空間構(gòu)型的差異如何影響原始T細(xì)胞活化，他們使用體外共培養(yǎng)測(cè)定法比較了系列IgG-[L]-scFv（圖6，B至F）。IL-2的分泌再次揭示了不同BsAb變體之間的主要差異。2+2引起的IL-2分泌明顯比所有其他BsAb更強(qiáng)，顯示出比下一個(gè)最具刺激性的變體高近100倍的效力（圖6B）。2+1、1+2和1+1C表現(xiàn)出中等效力，1+1T和1+1H在檢測(cè)下限附近誘導(dǎo)弱的IL-2分泌。T細(xì)胞的活化和增殖通常遵循相同的等級(jí)順序，盡管差異較小，并且對(duì)于CD4+和CD8+T細(xì)胞子集均保持一致（圖6，C-F）。2+2顯示出最高的效價(jià)，而1+1T始終是最弱的，與1+1H沒有區(qū)別，刺激性比2+2低約200倍。2+1、1+2和1+1C通常以中等強(qiáng)度聚集在一起，其中2+1顯示出更有效的激活，然后依次是1+2和1+1C。如前所述，與BsAb一起孵育但沒有腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞沒有表現(xiàn)出任何可測(cè)量的反應(yīng)，表明BsAb介導(dǎo)的T細(xì)胞活化是抗原依賴性的。 ? ? ? ?1+1C和1+1T之間的顯著性差異表明，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)型是體外BsAb活性的關(guān)鍵決定因素。此外，盡管2+2在2+1和1+2上顯示出更高的效力，但2+1和1+2都不優(yōu)于1+1C。因此，當(dāng)抗原結(jié)合域的增加創(chuàng)造了一個(gè)額外的順式結(jié)構(gòu)時(shí)，它最有效地改善了效力?？傊@些數(shù)據(jù)表明，IgG-[L]-scFv框架內(nèi)的雙重二價(jià)通過改善細(xì)胞結(jié)合并以順式結(jié)構(gòu)呈遞腫瘤和T細(xì)胞結(jié)合來增強(qiáng)BsAb功能。 ? ? ? ?在帶有皮下人黑素瘤（M14）腫瘤并用BsAb和huATC治療的DKO小鼠中（圖7A），2+2再次顯示出最強(qiáng)的抗腫瘤活性（圖7B）。2+1最初對(duì)2+2引起相似的反應(yīng)，但最終的持久性較差，治療結(jié)束后腫瘤迅速復(fù)發(fā)。與體外功能研究一致，1+2和1+1C均顯示中等的抗腫瘤活性，但明顯比2+1和2+2差。最后，相對(duì)于用對(duì)照BsAb治療的小鼠，1+1H和1+1T均未顯示任何抗腫瘤功效。 圖7. 系列IgG-[L]-scFv的體內(nèi)抗腫瘤活性。2+2為紫色，1+1H為紅色，2+1為藍(lán)色，1+1T為綠色，1+1C為棕色，1+2為橙色，控制組BsAb為灰色。 ? ? ? ?總體而言，這些結(jié)果與他們的體外研究結(jié)果一致，并證實(shí)了順式結(jié)構(gòu)的腫瘤和T細(xì)胞結(jié)合域的重要性。 ? ? ? ?原創(chuàng)內(nèi)容未經(jīng)授權(quán)，禁止轉(zhuǎn)載至其他平臺(tái)。
內(nèi)容來源： Santich B H, Park J A, Tran H, et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies[J]. Science Translational Medicine, 2020, 12(534). |
